Titulación de fagos.

¿Cómo saber cuantos virus existen aproximadamente en una dilución?

Los virus son por lo general organismos muy, muy pequeños, por lo que contarlos no sería tarea factible con los métodos que usamos con las bacterias. En estos casos, más que buscar turbidez o colonias, tendremos usar métodos indirectos, más concretamente la propia huella que deja el virus al matar bacterias.

Lógicamente esto sólo es posible con virus que parasitan bacterias.

Los virus son parásitos intracelulares obligados, necesitan utilizar la maquinaria de células vivas para poder multiplicarse. Los virus que infectan bacterias se llaman bacteriófagos o sencillamente fagos.

Existen dos clases de fagos:

·Fagos líticos o "virulentos", son los que tras introducir su información genética en la bacteria comienzan a dividirse hasta matar a la misma, liberándose al lisar la bacteria. (ciclo lítico)

·Fagos lisogénicos o "atenuados", tras infectar la bacteria, su genoma puede integrarse en el cromosoma bacteriano convirtiéndose en un profago que se divide a la vez que la bacteria (ciclo lisogénico) El virus puede liberarse y entrar en ciclo lítico.

From: Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 December 30; 105(52): 20705–20710.

Published online 2008 December 19. doi: 10.1073/pnas.0808831105

Para esta técnica necesitamos preparar una suspensión de fagos virulentos que se mezclarán en suspensión con bacterias susceptibles de ser infectadas, preferiblemente en fase exponencial. Se mantendrá el cultivo en suspensión para que los fagos se multipliquen y luego se centrifugará para eliminar los restos celulares.

Para calcular el número de partículas virales se mezcla una determinada dilución de la suspensión fágica con un cultivo bacteriano en fase exponencial y se coloca sobre la superficie de una placa de agar.

Tras la incubación se observa un césped bacteriano sobre el que aparecen pequeñas areas circulares más claras que corresponden a los virus. Estas áreas reciben el nombre de calvas de lisis.

Cada calva corresponde a la infección por un único virus por lo cual contando y realizando cálculas se puede llegar a conocer la carga vírica de la suspensión inicial en UFP/ml (unidades formadoras de placa por mililitro)

Entramos a más detalle en el procedimiento de recuento:

Hay que preparar diluciones decimales seriadas desde 10^-1 hasta 10^-9, además también prepararemos un control de la bacteria sin fagos y otro de fagos sin diluir.

Preparamos tubos con agar blando a los que añadimos 0'1 ml de la bacteria.

Luego añadimos 0'1 ml de cada disoluciones de fagos a los tubos de manera que tendremos un tubo con cada una de las disoluciones víricas, más el control y otro únicamente de fagos sin diluir. Luego añadiremos cada tubo a una palca con agar nutritivo y dejaremos solidificar, para poner luego a incubar.

Al día siguiente se observan las calvas de lisis, y se proceden a contar. Lo normal es que en las diluciones bajas sea muy difícil contar, así que lo haremos a partir de diluciones altas, cuando sea razonablemente posible.

Aquí vemos el resultado:

Placa control, que nos descarta la existencia de virus y confirma el crecimiento de nuestra bacteria. En este caso Escherichia coli Y190.

10^-6, como puede observarse contar las calvas es prácticamente imposible.

10^-7, el número de calvas empieza a ser más razonable.

10^-8, aquí ya podemos contar unas 44 calvas.

10^-9, en esta dilución contamos 6 calvas.

Confirmando que no se han producido saltos entre las diluciones ni contaminaciones, podemos dar con concluido el experimento. Para los cálculos finales usaremos la última placa en la que aparezcan calvas. El título corresponderá al número de calvas multiplicado por la dilución total. En este caso 6 x 10⁹ UFP/ml. Pero en otros casos, dependiendo de como se tomen, esta cuenta puede variar.

Es importante realizar siempre los experimentos por duplicado, para descartar saltos o problemas con alguno de los elementos implicados.